রোগীর সিরামের উচ্চ-রেজোলিউশন ভর বর্ণালিবীক্ষণ বিশ্লেষণ ব্যবহার করে মেটাবোলোমিক্স উচ্চ নির্দিষ্টতার সাথে সৌম্য এবং মারাত্মক ফুসফুসের নোডিউলগুলির মধ্যে পার্থক্য নির্ণয় করে।

কম্পিউটেড টমোগ্রাফি (সিটি) দ্বারা শনাক্তকৃত ফুসফুসের নোডিউলগুলির ডিফারেনশিয়াল ডায়াগনোসিস ক্লিনিক্যাল অনুশীলনে একটি চ্যালেঞ্জ হিসেবে রয়ে গেছে। এখানে, আমরা সুস্থ নিয়ন্ত্রণ, সৌম্য ফুসফুসের নোডিউল এবং প্রথম পর্যায়ের ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা সহ ৪৮০টি সিরাম নমুনার গ্লোবাল মেটাবোলোমের বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করেছি। অ্যাডেনোকার্সিনোমাগুলি স্বতন্ত্র মেটাবোলোমিক প্রোফাইল প্রদর্শন করে, যেখানে সৌম্য নোডিউল এবং সুস্থ ব্যক্তিদের মেটাবোলোমিক প্রোফাইলে উচ্চ সাদৃশ্য দেখা যায়। ডিসকভারি গ্রুপে (n = ৩০৬), সৌম্য এবং ম্যালিগন্যান্ট নোডিউলগুলির মধ্যে পার্থক্য করার জন্য ২৭টি মেটাবোলাইটের একটি সেট শনাক্ত করা হয়েছিল। অভ্যন্তরীণ বৈধতা (n = ১০৪) এবং বাহ্যিক বৈধতা (n = ১১১) গ্রুপে ডিসক্রিমিন্যান্ট মডেলের AUC ছিল যথাক্রমে ০.৯১৫ এবং ০.৯৪৫। পাথওয়ে বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে সৌম্য নোডিউল এবং সুস্থ নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা সিরামে ট্রিপটোফ্যান হ্রাসের সাথে সম্পর্কিত গ্লাইকোলাইটিক মেটাবোলাইট বৃদ্ধি পেয়েছে, এবং এটি ইঙ্গিত দেয় যে ট্রিপটোফ্যান গ্রহণ ফুসফুসের ক্যান্সার কোষগুলিতে গ্লাইকোলাইসিসকে উৎসাহিত করে। আমাদের গবেষণাটি সিটি স্ক্যানের মাধ্যমে শনাক্ত হওয়া ফুসফুসের নোডিউলের ঝুঁকি নির্ণয়ে সিরাম মেটাবোলাইট বায়োমার্কারের গুরুত্ব তুলে ধরে।
ক্যান্সার রোগীদের বেঁচে থাকার হার উন্নত করার জন্য প্রাথমিক রোগ নির্ণয় অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের ন্যাশনাল লাং ক্যান্সার স্ক্রিনিং ট্রায়াল (NLST) এবং ইউরোপীয় নেলসন স্টাডির ফলাফল থেকে দেখা গেছে যে, লো-ডোজ কম্পিউটেড টমোগ্রাফি (LDCT) দ্বারা স্ক্রিনিং উচ্চ-ঝুঁকিপূর্ণ গোষ্ঠীর মধ্যে ফুসফুসের ক্যান্সারে মৃত্যুর হার উল্লেখযোগ্যভাবে কমাতে পারে¹,²,³। ফুসফুসের ক্যান্সার স্ক্রিনিংয়ের জন্য LDCT-এর ব্যাপক ব্যবহারের পর থেকে, উপসর্গবিহীন পালমোনারি নডিউলের আকস্মিক রেডিওগ্রাফিক আবিষ্কারের হার ক্রমাগত বৃদ্ধি পাচ্ছে⁴। পালমোনারি নডিউলকে ৩ সেমি ব্যাস পর্যন্ত ফোকাল অপাসিটি হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়⁵। ম্যালিগন্যান্সির সম্ভাবনা নির্ণয় করা এবং LDCT-তে আকস্মিকভাবে সনাক্ত হওয়া বিপুল সংখ্যক পালমোনারি নডিউল নিয়ে কাজ করতে আমরা সমস্যার সম্মুখীন হই। সিটি স্ক্যানের সীমাবদ্ধতার কারণে ঘন ঘন ফলো-আপ পরীক্ষা এবং ফলস-পজিটিভ ফলাফল হতে পারে, যা অপ্রয়োজনীয় হস্তক্ষেপ এবং অতিরিক্ত চিকিৎসার দিকে পরিচালিত করে⁶। অতএব, প্রাথমিক পর্যায়ে ফুসফুসের ক্যান্সার সঠিকভাবে সনাক্ত করতে এবং প্রাথমিক সনাক্তকরণে বেশিরভাগ সৌম্য নডিউলকে আলাদা করার জন্য নির্ভরযোগ্য এবং কার্যকর বায়োমার্কার তৈরি করার প্রয়োজন রয়েছে⁷।
রক্তের (সিরাম, প্লাজমা, পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার সেল) জিনোমিক্স, প্রোটিওমিক্স বা ডিএনএ মিথাইলেশন৮,৯,১০ সহ ব্যাপক আণবিক বিশ্লেষণ ফুসফুসের ক্যান্সারের জন্য ডায়াগনস্টিক বায়োমার্কার আবিষ্কারে আগ্রহ বাড়িয়ে দিয়েছে। এদিকে, মেটাবোলোমিক্স পদ্ধতিগুলি কোষীয় শেষ পণ্য পরিমাপ করে যা অন্তঃসত্ত্বা এবং বহিঃসত্ত্বা ক্রিয়া দ্বারা প্রভাবিত হয় এবং তাই রোগের সূত্রপাত এবং ফলাফল ভবিষ্যদ্বাণী করতে প্রয়োগ করা হয়। লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) মেটাবোলোমিক্স গবেষণার জন্য একটি বহুল ব্যবহৃত পদ্ধতি, কারণ এর উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং বৃহৎ ডায়নামিক রেঞ্জ রয়েছে, যা বিভিন্ন ভৌত-রাসায়নিক বৈশিষ্ট্যযুক্ত মেটাবোলাইটগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করতে পারে১১,১২,১৩। যদিও প্লাজমা/সিরামের গ্লোবাল মেটাবোলোমিক বিশ্লেষণ ফুসফুসের ক্যান্সার নির্ণয়১৪,১৫,১৬,১৭ এবং চিকিৎসার কার্যকারিতা১৮ এর সাথে সম্পর্কিত বায়োমার্কার সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছে, সৌম্য এবং ম্যালিগন্যান্ট ফুসফুসের নোডিউলের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য সিরাম মেটাবোলাইট ক্লাসিফায়ারগুলি এখনও ব্যাপকভাবে অধ্যয়ন করা বাকি। - ব্যাপক গবেষণা।
অ্যাডেনোকার্সিনোমা এবং স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা হলো নন-স্মল সেল লাং ক্যান্সার (NSCLC)-এর দুটি প্রধান উপপ্রকার। বিভিন্ন সিটি স্ক্রিনিং পরীক্ষা ইঙ্গিত দেয় যে অ্যাডেনোকার্সিনোমা হলো ফুসফুস ক্যান্সারের সবচেয়ে সাধারণ হিস্টোলজিক্যাল ধরণ¹,¹⁹,²⁰,²¹। এই গবেষণায়, আমরা আল্ট্রা-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-হাই-রেজোলিউশন মাস স্পেকট্রোমেট্রি (UPLC-HRMS) ব্যবহার করে মোট ৬৯৫টি সিরাম নমুনার উপর মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণ করেছি, যার মধ্যে সুস্থ নিয়ন্ত্রণ, সৌম্য ফুসফুসীয় নোডিউল এবং সিটি-তে শনাক্তকৃত ≤৩ সেমি আকারের স্টেজ I ফুসফুস অ্যাডেনোকার্সিনোমার স্ক্রিনিং অন্তর্ভুক্ত ছিল। আমরা সিরাম মেটাবোলাইটের একটি প্যানেল শনাক্ত করেছি যা ফুসফুস অ্যাডেনোকার্সিনোমাকে সৌম্য নোডিউল এবং সুস্থ নিয়ন্ত্রণ থেকে আলাদা করে। পাথওয়ে এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ থেকে জানা যায় যে, সৌম্য নোডিউল এবং সুস্থ নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ফুসফুস অ্যাডেনোকার্সিনোমাতে অস্বাভাবিক ট্রিপটোফ্যান এবং গ্লুকোজ বিপাক একটি সাধারণ পরিবর্তন। অবশেষে, আমরা এলডিসিটি (LDCT) দ্বারা শনাক্তকৃত ম্যালিগন্যান্ট এবং বিনাইন পালমোনারি নডিউলগুলির মধ্যে পার্থক্য করার জন্য উচ্চ স্পেসিফিসিটি ও সেনসিটিভিটি সম্পন্ন একটি সিরাম মেটাবলিক ক্লাসিফায়ার প্রতিষ্ঠা ও যাচাই করেছি, যা প্রাথমিক ডিফারেনশিয়াল ডায়াগনোসিস এবং ঝুঁকি মূল্যায়নে সহায়তা করতে পারে।
বর্তমান গবেষণায়, ১৭৪ জন সুস্থ ব্যক্তি, ২৯২ জন সৌম্য ফুসফুসীয় নডিউলযুক্ত রোগী এবং ২২৯ জন প্রথম পর্যায়ের ফুসফুস অ্যাডেনোকার্সিনোমা রোগীর কাছ থেকে পূর্ববর্তী সময়ের লিঙ্গ ও বয়স-সদৃশ সিরামের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। এই ৬৯৫ জন অংশগ্রহণকারীর জনতাত্ত্বিক বৈশিষ্ট্য পরিশিষ্ট সারণি ১-এ দেখানো হয়েছে।
চিত্র ১ক-তে যেমন দেখানো হয়েছে, সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার সেন্টার থেকে মোট ৪৮০টি সিরামের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল, যার মধ্যে ছিল ১৭৪টি সুস্থ নিয়ন্ত্রক (HC), ১৭০টি সৌম্য নোডিউল (BN) এবং ১৩৬টি প্রথম পর্যায়ের ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LA) নমুনা। আল্ট্রা-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-হাই-রেজোলিউশন মাস স্পেকট্রোমেট্রি (UPLC-HRMS) ব্যবহার করে আনটার্গেটেড মেটাবোলোমিক প্রোফাইলিংয়ের জন্য ডিসকভারি কোহর্ট। পরিপূরক চিত্র ১-এ যেমন দেখানো হয়েছে, একটি শ্রেণিবিন্যাস মডেল প্রতিষ্ঠা করতে এবং ডিফারেনশিয়াল পাথওয়ে বিশ্লেষণ আরও অন্বেষণ করার জন্য LA ও HC, এবং LA ও BN-এর মধ্যে ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলাইটগুলো শনাক্ত করা হয়েছিল। সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার সেন্টার দ্বারা সংগৃহীত ১০৪টি নমুনা এবং অন্য দুটি হাসপাতাল দ্বারা সংগৃহীত ১১১টি নমুনা যথাক্রমে অভ্যন্তরীণ এবং বাহ্যিক যাচাইকরণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।
ক) ডিসকভারি কোহর্টের অধ্যয়ন জনগোষ্ঠী যাদের আল্ট্রা-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-হাই-রেজোলিউশন মাস স্পেকট্রোমেট্রি (UPLC-HRMS) ব্যবহার করে গ্লোবাল সিরাম মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণ করা হয়েছে। খ) অধ্যয়ন কোহর্টের ৪৮০টি সিরাম নমুনার মোট মেটাবোলোমের পার্শিয়াল লিস্ট স্কোয়ার্স ডিসক্রিমিন্যান্ট অ্যানালাইসিস (PLS-DA), যার মধ্যে রয়েছে স্বাস্থ্যবান নিয়ন্ত্রক (HC, n = ১৭৪), সৌম্য নডিউল (BN, n = ১৭০), এবং প্রথম পর্যায়ের ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (লস অ্যাঞ্জেলেস, n = ১৩৬)। +ESI, পজিটিভ ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন মোড, -ESI, নেগেটিভ ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন মোড। গ–ঙ) দুটি নির্দিষ্ট গ্রুপের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্যযুক্ত মেটাবোলাইটগুলো (টু-টেইলড উইলকক্সন সাইনড র‍্যাঙ্ক টেস্ট, ফলস ডিসকভারি রেট অ্যাডজাস্টেড পি ভ্যালু, FDR <০.০৫) লাল (ফোল্ড চেঞ্জ > ১.২) এবং নীল (ফোল্ড চেঞ্জ < ০.৮৩) রঙে দেখানো হয়েছে। ভলকানো গ্রাফিকে দেখানো হয়েছে। f হায়ারারকিক্যাল ক্লাস্টারিং হিট ম্যাপ, যা LA এবং BN-এর মধ্যে অ্যানোটেটেড মেটাবোলাইটের সংখ্যায় উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখাচ্ছে। উৎস ডেটা সোর্স ডেটা ফাইল আকারে সরবরাহ করা হয়েছে।
ডিসকভারি গ্রুপের ১৭৪ জন এইচসি, ১৭০ জন বিএন এবং ১৩৬ জন এলএ-এর মোট সিরাম মেটাবোলোম ইউপিএলসি-এইচআরএমএস বিশ্লেষণের মাধ্যমে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আমরা প্রথমে দেখাই যে কোয়ালিটি কন্ট্রোল (কিউসি) নমুনাগুলি একটি আনসুপারভাইজড প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (পিসিএ) মডেলের কেন্দ্রে নিবিড়ভাবে ক্লাস্টার করে, যা বর্তমান গবেষণার পারফরম্যান্সের স্থিতিশীলতা নিশ্চিত করে (পরিশিষ্ট চিত্র ২)।
চিত্র ১ খ-তে দেখানো পার্শিয়াল লিস্ট স্কোয়ার্স-ডিসক্রিমিন্যান্ট অ্যানালাইসিস (PLS-DA) অনুসারে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে পজিটিভ (+ESI) এবং নেগেটিভ (−ESI) ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন মোডে LA ও BN এবং LA ও HC-এর মধ্যে সুস্পষ্ট পার্থক্য ছিল। তবে, +ESI এবং -ESI পরিস্থিতিতে BN ও HC-এর মধ্যে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পাওয়া যায়নি।
আমরা LA এবং HC-এর মধ্যে ৩৮২টি ডিফারেনশিয়াল ফিচার, LA এবং BN-এর মধ্যে ২৩১টি ডিফারেনশিয়াল ফিচার, এবং BN এবং HC-এর মধ্যে ৯৫টি ডিফারেনশিয়াল ফিচার খুঁজে পেয়েছি (উইলকক্সন সাইনড র‍্যাঙ্ক টেস্ট, FDR <০.০৫ এবং মাল্টিপল চেঞ্জ >১.২ বা <০.৮৩) (চিত্র .১সি-ই)। পিকগুলোকে পরবর্তীতে একটি ডাটাবেসের (mzCloud/HMDB/Chemspider লাইব্রেরি) বিপরীতে m/z ভ্যালু, রিটেনশন টাইম এবং ফ্র্যাগমেন্টেশন মাস স্পেকট্রাম সার্চের মাধ্যমে অ্যানোটেট করা হয়েছিল (সাপ্লিমেন্টারি ডেটা ৩) (বিস্তারিত মেথডস সেকশনে বর্ণনা করা হয়েছে) ২২। অবশেষে, LA বনাম BN (চিত্র 1f এবং সাপ্লিমেন্টারি টেবিল 2) এবং LA বনাম HC (সাপ্লিমেন্টারি চিত্র 3 এবং সাপ্লিমেন্টারি টেবিল 2)-এর জন্য যথাক্রমে প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্যসহ ৩৩ এবং ৩৮টি অ্যানোটেটেড মেটাবোলাইট শনাক্ত করা হয়েছিল। বিপরীতে, BN এবং HC-তে প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্যসহ মাত্র ৩টি মেটাবোলাইট শনাক্ত করা হয়েছিল (সাপ্লিমেন্টারি টেবিল 2), যা PLS-DA-তে BN এবং HC-এর মধ্যে ওভারল্যাপের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এই ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলাইটগুলো বিস্তৃত পরিসরের জৈব রাসায়নিক পদার্থকে অন্তর্ভুক্ত করে (পরিপূরক চিত্র ৪)। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলো সিরাম মেটাবোলোমের উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন প্রদর্শন করে, যা সৌম্য ফুসফুসের নোডিউল বা সুস্থ ব্যক্তিদের তুলনায় প্রাথমিক পর্যায়ের ফুসফুস ক্যান্সারের ম্যালিগন্যান্ট রূপান্তরকে প্রতিফলিত করে। এদিকে, BN এবং HC-এর সিরাম মেটাবোলোমের সাদৃশ্য ইঙ্গিত দেয় যে সৌম্য পালমোনারি নোডিউলগুলো সুস্থ ব্যক্তিদের সাথে অনেক জৈবিক বৈশিষ্ট্য ভাগ করে নিতে পারে। যেহেতু ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা সাবটাইপ ২৩-এ এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর রিসেপ্টর (EGFR) জিনের মিউটেশন সাধারণ, তাই আমরা সিরাম মেটাবোলোমের উপর ড্রাইভার মিউটেশনের প্রভাব নির্ধারণ করার চেষ্টা করেছি। এরপর আমরা ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা গ্রুপের EGFR স্ট্যাটাসযুক্ত ৭২টি কেসের সামগ্রিক মেটাবোলোমিক প্রোফাইল বিশ্লেষণ করেছি। মজার বিষয় হলো, PCA বিশ্লেষণে আমরা EGFR মিউট্যান্ট রোগী (n = ৪১) এবং EGFR ওয়াইল্ড-টাইপ রোগীদের (n = ৩১) মধ্যে তুলনীয় প্রোফাইল পেয়েছি (পরিপূরক চিত্র ৫ক)। তবে, আমরা ৭টি মেটাবোলাইট শনাক্ত করেছি, যেগুলোর প্রাচুর্য ওয়াইল্ড-টাইপ EGFR যুক্ত রোগীদের তুলনায় EGFR মিউটেশন যুক্ত রোগীদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছিল (টি টেস্ট, পি < ০.০৫ এবং ফোল্ড চেঞ্জ > ১.২ বা < ০.৮৩) (পরিশিষ্ট চিত্র ৫বি)। এই মেটাবোলাইটগুলোর অধিকাংশই (৭টির মধ্যে ৫টি) হলো অ্যাসাইলকার্নিটিন, যা ফ্যাটি অ্যাসিড জারণ প্রক্রিয়ায় একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে।
চিত্র ২ক-তে দেখানো কার্যপ্রবাহ অনুসারে, লিস্ট অ্যাবসোলিউট শ্রিঙ্কেজ অপারেটর এবং LA (n = ১৩৬) ও BN (n = ১৭০)-তে শনাক্তকৃত ৩৩টি ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলাইটের উপর ভিত্তি করে নির্বাচনের মাধ্যমে নোডিউল শ্রেণিবিন্যাসের জন্য বায়োমার্কারসমূহ সংগ্রহ করা হয়েছিল। ভ্যারিয়েবলসমূহের সর্বোত্তম সমন্বয় (LASSO) – বাইনারি লজিস্টিক রিগ্রেশন মডেল। মডেলটির নির্ভরযোগ্যতা পরীক্ষা করার জন্য টেন-ফোল্ড ক্রস-ভ্যালিডেশন ব্যবহার করা হয়েছিল। ভ্যারিয়েবল নির্বাচন এবং প্যারামিটার রেগুলাইজেশন λ২৪ প্যারামিটারসহ একটি লাইকলিহুড ম্যাক্সিমাইজেশন পেনাল্টি দ্বারা সমন্বয় করা হয়। ডিসক্রিমিন্যান্ট মডেলটির শ্রেণিবিন্যাস কার্যকারিতা পরীক্ষা করার জন্য অভ্যন্তরীণ ভ্যালিডেশন (n = ১০৪) এবং বাহ্যিক ভ্যালিডেশন (n = ১১১) গ্রুপে স্বাধীনভাবে গ্লোবাল মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণ আরও সম্পন্ন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ, ডিসকভারি সেটের ২৭টি মেটাবোলাইটকে সর্বোচ্চ গড় AUC মানসহ সেরা ডিসক্রিমিন্যান্ট মডেল হিসেবে শনাক্ত করা হয় (চিত্র ২খ), যার মধ্যে BN-এর তুলনায় LA-তে ৯টির সক্রিয়তা বৃদ্ধি এবং ১৮টির সক্রিয়তা হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র ২গ)।
পালমোনারি নডিউল ক্লাসিফায়ার তৈরির কার্যপ্রবাহ, যার মধ্যে রয়েছে দশ-গুণ ক্রস-ভ্যালিডেশনের মাধ্যমে একটি বাইনারি লজিস্টিক রিগ্রেশন মডেল ব্যবহার করে ডিসকভারি সেট থেকে সিরাম মেটাবোলাইটের সেরা প্যানেল নির্বাচন করা এবং অভ্যন্তরীণ ও বাহ্যিক ভ্যালিডেশন সেটে ভবিষ্যদ্বাণীমূলক কার্যকারিতা মূল্যায়ন করা। খ মেটাবলিক বায়োমার্কার নির্বাচনের জন্য LASSO রিগ্রেশন মডেলের ক্রস-ভ্যালিডেশন পরিসংখ্যান। উপরে প্রদত্ত সংখ্যাগুলো একটি নির্দিষ্ট λ-তে নির্বাচিত বায়োমার্কারের গড় সংখ্যা নির্দেশ করে। লাল ডটেড লাইনটি সংশ্লিষ্ট ল্যাম্বডাতে গড় AUC মান নির্দেশ করে। ধূসর এরর বারগুলো সর্বনিম্ন এবং সর্বোচ্চ AUC মান নির্দেশ করে। ডটেড লাইনটি ২৭টি নির্বাচিত বায়োমার্কারসহ সেরা মডেলটিকে নির্দেশ করে। AUC, রিসিভার অপারেটিং ক্যারেক্টারিস্টিক (ROC) কার্ভের নিচের ক্ষেত্রফল। গ ডিসকভারি গ্রুপে BN গ্রুপের তুলনায় LA গ্রুপে ২৭টি নির্বাচিত মেটাবোলাইটের ফোল্ড পরিবর্তন। লাল কলাম – সক্রিয়করণ। নীল কলামটি হ্রাস নির্দেশ করে। ঘ–চ ডিসকভারি, অভ্যন্তরীণ এবং বাহ্যিক ভ্যালিডেশন সেটে ২৭টি মেটাবোলাইট সমন্বয়ের উপর ভিত্তি করে ডিসক্রিমিন্যান্ট মডেলের ক্ষমতা প্রদর্শনকারী রিসিভার অপারেটিং ক্যারেক্টারিস্টিক (ROC) কার্ভ। উৎস ডেটা সোর্স ডেটা ফাইলের আকারে সরবরাহ করা হয়েছে।
এই ২৭টি মেটাবোলাইটের ওয়েটেড রিগ্রেশন কোএফিসিয়েন্টের উপর ভিত্তি করে একটি প্রেডিকশন মডেল তৈরি করা হয়েছিল (সাপ্লিমেন্টারি টেবিল ৩)। এই ২৭টি মেটাবোলাইটের উপর ভিত্তি করে করা ROC বিশ্লেষণে এরিয়া আন্ডার দ্য কার্ভ (AUC) মান পাওয়া যায় ০.৯৩৩, ডিসকভারি গ্রুপের সেনসিটিভিটি ছিল ০.৮৬৮ এবং স্পেসিফিসিটি ছিল ০.৮৫৯ (চিত্র ২ডি)। এদিকে, LA এবং HC-এর মধ্যে চিহ্নিত ৩৮টি ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলাইটের মধ্যে, ১৬টি মেটাবোলাইটের একটি সেট LA-কে HC থেকে আলাদা করার ক্ষেত্রে ০.৯০২-এর একটি AUC, ০.৮০১-এর সেনসিটিভিটি এবং ০.৮৫৬-এর স্পেসিফিসিটি অর্জন করেছে (সাপ্লিমেন্টারি চিত্র ৬এ-সি)। ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলাইটগুলোর জন্য বিভিন্ন ফোল্ড চেঞ্জ থ্রেশহোল্ডের উপর ভিত্তি করে প্রাপ্ত AUC মানগুলোও তুলনা করা হয়েছিল। আমরা দেখতে পেয়েছি যে, যখন ফোল্ড চেঞ্জ লেভেল ১.৫ বা ২.০-এর পরিবর্তে ১.২ নির্ধারণ করা হয়েছিল, তখন ক্লাসিফিকেশন মডেলটি LA এবং BN (HC)-এর মধ্যে পার্থক্য করার ক্ষেত্রে সবচেয়ে ভালো কাজ করেছে (সাপ্লিমেন্টারি চিত্র ৭এ,বি)। ২৭টি মেটাবোলাইট গ্রুপের উপর ভিত্তি করে তৈরি ক্লাসিফিকেশন মডেলটি অভ্যন্তরীণ এবং বাহ্যিক কোহর্টে আরও যাচাই করা হয়েছিল। অভ্যন্তরীণ যাচাইকরণের জন্য AUC ছিল ০.৯১৫ (সংবেদনশীলতা ০.৮৬৭, নির্দিষ্টতা ০.৮১১) এবং বাহ্যিক যাচাইকরণের জন্য ছিল ০.৯৪৫ (সংবেদনশীলতা ০.৮১০, নির্দিষ্টতা ০.৯৭৯) (চিত্র ২e, f)। আন্তঃল্যাবরেটরি দক্ষতা মূল্যায়ন করার জন্য, মেথডস বিভাগে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে বাহ্যিক কোহর্ট থেকে ৪০টি নমুনা একটি বাহ্যিক ল্যাবরেটরিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ক্লাসিফিকেশন নির্ভুলতা ০.৯২৫ এর একটি AUC অর্জন করেছে (পরিপূরক চিত্র ৮)। যেহেতু ফুসফুসের স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা (LUSC) ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার (LUAD) পরে নন-স্মল সেল লাং ক্যান্সারের (NSCLC) দ্বিতীয় সর্বাধিক প্রচলিত উপপ্রকার, তাই আমরা মেটাবলিক প্রোফাইলের যাচাইকৃত সম্ভাব্য উপযোগিতাও পরীক্ষা করেছি। BN এবং LUSC-এর ১৬টি কেস। LUSC এবং BN-এর মধ্যে পার্থক্য নির্ণয়ের AUC ছিল ০.৭৭৬ (পরিশিষ্ট চিত্র ৯), যা LUAD এবং BN-এর মধ্যে পার্থক্য নির্ণয়ের তুলনায় দুর্বলতর সক্ষমতা নির্দেশ করে।
গবেষণায় দেখা গেছে যে সিটি ইমেজে নোডিউলের আকার ম্যালিগন্যান্সির সম্ভাবনার সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কিত এবং নোডিউল চিকিৎসার একটি প্রধান নির্ধারক হিসেবে কাজ করে^25,26,27। নেলসন স্ক্রিনিং স্টাডির বৃহৎ কোহর্টের ডেটা বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, <5 মিমি নোডযুক্ত ব্যক্তিদের মধ্যে ম্যালিগন্যান্সির ঝুঁকি এমনকি নোডবিহীন ব্যক্তিদের ঝুঁকির মতোই ছিল²⁸। অতএব, ব্রিটিশ থোরাসিক সোসাইটি (বিটিএস) এর সুপারিশ অনুযায়ী নিয়মিত সিটি পর্যবেক্ষণের জন্য ন্যূনতম আকার হল 5 মিমি, এবং ফ্লেইশনার সোসাইটির সুপারিশ অনুযায়ী 6 মিমি²⁹। যাইহোক, 6 মিমি-এর চেয়ে বড় এবং সুস্পষ্ট সৌম্য বৈশিষ্ট্যবিহীন নোডিউল, যেগুলোকে ইনডিটারমিনেট পালমোনারি নোডিউল (আইপিএন) বলা হয়, ক্লিনিক্যাল অনুশীলনে মূল্যায়ন এবং ব্যবস্থাপনার ক্ষেত্রে একটি বড় চ্যালেঞ্জ হিসেবে রয়ে গেছে^30,31। এরপর আমরা ডিসকভারি এবং ইন্টারনাল ভ্যালিডেশন কোহর্ট থেকে সংগৃহীত নমুনা ব্যবহার করে পরীক্ষা করে দেখেছি যে নোডিউলের আকার মেটাবোলোমিক সিগনেচারকে প্রভাবিত করে কিনা। 27টি যাচাইকৃত বায়োমার্কারের উপর মনোযোগ দিয়ে, আমরা প্রথমে এইচসি এবং বিএন সাব-6 মিমি মেটাবোলোমের পিসিএ প্রোফাইল তুলনা করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে HC এবং BN-এর বেশিরভাগ ডেটা পয়েন্ট একে অপরের সাথে মিলে গেছে, যা প্রমাণ করে যে উভয় গ্রুপেই সিরাম মেটাবোলাইটের মাত্রা একই রকম ছিল (চিত্র ৩ক)। BN এবং LA-তে বিভিন্ন আকারের পরিসরে ফিচার ম্যাপগুলো অপরিবর্তিত ছিল (চিত্র ৩খ, গ), যেখানে ৬-২০ মিমি পরিসরে ম্যালিগন্যান্ট এবং বিনাইন নডিউলগুলোর মধ্যে একটি পার্থক্য লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র ৩ঘ)। ৬ থেকে ২০ মিমি আকারের নডিউলগুলোর ম্যালিগন্যান্সি পূর্বাভাস দেওয়ার ক্ষেত্রে এই কোহর্টের AUC ছিল ০.৯২৭, স্পেসিফিসিটি ০.৮৬৮ এবং সেনসিটিভিটি ০.৮২০ (চিত্র ৩ঙ, চ)। আমাদের ফলাফল দেখায় যে, ক্লাসিফায়ারটি নডিউলের আকার নির্বিশেষে, প্রাথমিক ম্যালিগন্যান্ট রূপান্তরের কারণে সৃষ্ট মেটাবলিক পরিবর্তনগুলো শনাক্ত করতে পারে।
ক) ২৭টি মেটাবোলাইটের একটি মেটাবলিক ক্লাসিফায়ারের উপর ভিত্তি করে নির্দিষ্ট গ্রুপগুলির মধ্যে পিসিএ প্রোফাইলের তুলনা। সিসি এবং বিএন < ৬ মিমি। খ) বিএন < ৬ মিমি বনাম বিএন ৬–২০ মিমি। এলএ ৬–২০ মিমি বনাম এলএ ২০–৩০ মিমি। ছ) বিএন ৬–২০ মিমি এবং এলএ ৬–২০ মিমি। জিসি, এন = ১৭৪; বিএন < ৬ মিমি, এন = ১৫৩; বিএন ৬–২০ মিমি, এন = ৯১; এলএ ৬–২০ মিমি, এন = ৮৯; এলএ ২০–৩০ মিমি, এন = ৭৭। ঙ) রিসিভার অপারেটিং ক্যারেক্টারিস্টিক (ROC) কার্ভ যা ৬–২০ মিমি নডিউলগুলির জন্য ডিসক্রিমিন্যান্ট মডেলের পারফরম্যান্স দেখাচ্ছে। চ) ৬–২০ মিমি মাপের নডিউলগুলির জন্য লজিস্টিক রিগ্রেশন মডেলের উপর ভিত্তি করে সম্ভাব্যতা মান গণনা করা হয়েছিল। ধূসর ডটেড লাইনটি সর্বোত্তম কাটঅফ মান (০.৪৫৫) নির্দেশ করে। উপরের সংখ্যাগুলি লস অ্যাঞ্জেলেসের জন্য প্রক্ষেপিত কেসের শতাংশ নির্দেশ করে। দ্বি-পুচ্ছ স্টুডেন্ট'স টি পরীক্ষা ব্যবহার করুন। পিসিএ (PCA), প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস। এইউসি (AUC), এরিয়া আন্ডার দ্য কার্ভ। উৎস ডেটা সোর্স ডেটা ফাইল আকারে সরবরাহ করা হয়।
প্রস্তাবিত ম্যালিগন্যান্সি পূর্বাভাস মডেলের কার্যকারিতা প্রদর্শনের জন্য একই আকারের (৭-৯ মিমি) ফুসফুসীয় নোডিউলযুক্ত চারটি নমুনা (বয়স ৪৪-৬১ বছর) নির্বাচন করা হয়েছিল (চিত্র ৪ক, খ)। প্রাথমিক স্ক্রিনিং-এ, কেস ১ একটি ক্যালসিফিকেশনযুক্ত সলিড নোডিউল হিসাবে দেখা দেয়, যা বিনাইন হওয়ার একটি বৈশিষ্ট্য, যেখানে কেস ২ একটি অনির্দিষ্ট আংশিক সলিড নোডিউল হিসাবে দেখা দেয়, যাতে কোনো সুস্পষ্ট বিনাইন বৈশিষ্ট্য ছিল না। তিন রাউন্ড ফলো-আপ সিটি স্ক্যানে দেখা যায় যে এই কেসগুলো ৪ বছর ধরে স্থিতিশীল ছিল এবং তাই এগুলোকে বিনাইন নোডিউল হিসাবে বিবেচনা করা হয়েছিল (চিত্র ৪ক)। ধারাবাহিক সিটি স্ক্যানের ক্লিনিক্যাল মূল্যায়নের তুলনায়, বর্তমান ক্লাসিফায়ার মডেলের সাহায্যে সিঙ্গেল-শট সিরাম মেটাবোলাইট বিশ্লেষণ সম্ভাবনামূলক সীমাবদ্ধতার উপর ভিত্তি করে এই বিনাইন নোডিউলগুলোকে দ্রুত এবং সঠিকভাবে শনাক্ত করেছে (সারণি ১)। কেস ৩-এর চিত্র ৪খ-তে প্লুরাল রিট্র্যাকশনের লক্ষণসহ একটি নোডিউল দেখানো হয়েছে, যা প্রায়শই ম্যালিগন্যান্সির সাথে সম্পর্কিত³²। কেস ৪ একটি অনির্দিষ্ট আংশিক সলিড নোডিউল হিসাবে দেখা দেয়, যেখানে কোনো বিনাইন কারণের প্রমাণ ছিল না। ক্লাসিফায়ার মডেল অনুসারে এই সমস্ত কেস ম্যালিগন্যান্ট হিসেবে পূর্বাভাস দেওয়া হয়েছিল (সারণি ১)। ফুসফুস রিসেকশন সার্জারির পর হিস্টোপ্যাথলজিক্যাল পরীক্ষার মাধ্যমে ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার বিষয়টি নিশ্চিত করা হয় (চিত্র ৪খ)। এক্সটার্নাল ভ্যালিডেশন সেটের ক্ষেত্রে, মেটাবলিক ক্লাসিফায়ারটি ৬ মিমি-এর চেয়ে বড় দুটি অনির্দিষ্ট ফুসফুসের নডিউলের কেস সঠিকভাবে শনাক্ত করতে পেরেছিল (পরিপূরক চিত্র ১০)।
দুটি সৌম্য নডিউলের ক্ষেত্রে ফুসফুসের অ্যাক্সিয়াল উইন্ডোর সিটি চিত্র। কেস ১-এ, ৪ বছর পর করা সিটি স্ক্যানে ডান নিম্ন লোবে ক্যালসিফিকেশন সহ ৭ মিমি পরিমাপের একটি স্থিতিশীল কঠিন নডিউল দেখা যায়। কেস ২-এ, ৫ বছর পর করা সিটি স্ক্যানে ডান উচ্চ লোবে ৭ মিমি ব্যাসের একটি স্থিতিশীল, আংশিকভাবে কঠিন নডিউল প্রকাশ পায়। খ) ফুসফুস রিসেকশনের আগে স্টেজ I অ্যাডেনোকার্সিনোমার দুটি কেসের ফুসফুসের অ্যাক্সিয়াল উইন্ডো সিটি চিত্র এবং সংশ্লিষ্ট প্যাথলজিক্যাল স্টাডি। কেস ৩-এ প্লুরাল রিট্র্যাকশন সহ ডান উচ্চ লোবে ৮ মিমি ব্যাসের একটি নডিউল প্রকাশ পায়। কেস ৪-এ বাম উচ্চ লোবে ৯ মিমি পরিমাপের একটি আংশিকভাবে কঠিন গ্রাউন্ড-গ্লাস নডিউল প্রকাশ পায়। রিসেকশন করা ফুসফুসের টিস্যুর হেমাটোক্সিলিন এবং ইওসিন (H&E) স্টেইনিং (স্কেল বার = ৫০ μm) ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার অ্যাসিনার বৃদ্ধির ধরণ প্রদর্শন করছে। তীর চিহ্নগুলো সিটি চিত্রে শনাক্ত করা নডিউলগুলোকে নির্দেশ করে। এইচঅ্যান্ডই (H&E) চিত্রগুলি হলো প্যাথলজিস্ট দ্বারা পরীক্ষিত একাধিক (>৩) আণুবীক্ষণিক ক্ষেত্রের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র।
সামগ্রিকভাবে, আমাদের ফলাফলগুলো ফুসফুসের নোডিউলের ডিফারেনশিয়াল ডায়াগনোসিসে সিরাম মেটাবোলাইট বায়োমার্কারের সম্ভাব্য উপযোগিতা তুলে ধরে, যা সিটি স্ক্রিনিং মূল্যায়নের ক্ষেত্রে চ্যালেঞ্জ তৈরি করতে পারে।
একটি যাচাইকৃত ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলাইট প্যানেলের উপর ভিত্তি করে, আমরা প্রধান বিপাকীয় পরিবর্তনগুলির জৈবিক সম্পর্ক শনাক্ত করার চেষ্টা করেছি। MetaboAnalyst দ্বারা KEGG পাথওয়ে এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ দুটি প্রদত্ত গ্রুপের মধ্যে ৬টি সাধারণ উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত পাথওয়ে শনাক্ত করেছে (LA বনাম HC এবং LA বনাম BN, অ্যাডজাস্টেড p ≤ ০.০০১, প্রভাব > ০.০১)। এই পরিবর্তনগুলি পাইরুভেট বিপাক, ট্রিপটোফ্যান বিপাক, নিয়াসিন ও নিকোটিনামাইড বিপাক, গ্লাইকোলাইসিস, TCA চক্র এবং পিউরিন বিপাকের ব্যাঘাত দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল (চিত্র ৫ক)। এরপর আমরা অ্যাবসোলিউট কোয়ান্টিফিকেশন ব্যবহার করে প্রধান পরিবর্তনগুলি যাচাই করার জন্য টার্গেটেড মেটাবোলোমিক্স সম্পাদন করেছি। খাঁটি মেটাবোলাইট স্ট্যান্ডার্ড ব্যবহার করে ট্রিপল কোয়াড্রুপল মাস স্পেকট্রোমেট্রি (QQQ) দ্বারা সাধারণভাবে পরিবর্তিত পাথওয়েগুলিতে সাধারণ মেটাবোলাইটগুলির নির্ধারণ করা হয়েছে। মেটাবোলোমিক্স গবেষণার লক্ষ্য নমুনার জনতাত্ত্বিক বৈশিষ্ট্যসমূহ পরিপূরক সারণি ৪-এ অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে। আমাদের বৈশ্বিক মেটাবোলোমিক্স ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, পরিমাণগত বিশ্লেষণে নিশ্চিত হওয়া গেছে যে BN এবং HC-এর তুলনায় LA-তে হাইপোক্সান্থিন ও জ্যান্থিন, পাইরুভেট এবং ল্যাকটেটের পরিমাণ বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র ৫খ, গ, পি <০.০৫)। তবে, BN এবং HC-এর মধ্যে এই মেটাবোলাইটগুলোতে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পাওয়া যায়নি।
BN এবং HC গ্রুপের তুলনায় LA গ্রুপে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন মেটাবোলাইটগুলির KEGG পাথওয়ে এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ। একটি দ্বি-পুচ্ছ গ্লোবালটেস্ট ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং p মানগুলি Holm-Bonferroni পদ্ধতি ব্যবহার করে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল (সামঞ্জস্যপূর্ণ p ≤ 0.001 এবং এফেক্ট সাইজ > 0.01)। b–d ভায়োলিন প্লট যা LC-MS/MS দ্বারা নির্ধারিত সিরাম HC, BN, এবং LA-তে হাইপোক্সান্থিন, জ্যান্থিন, ল্যাকটেট, পাইরুভেট, এবং ট্রিপটোফ্যানের মাত্রা দেখাচ্ছে (প্রতি গ্রুপে n = 70)। সাদা এবং কালো ডটেড লাইনগুলি যথাক্রমে মিডিয়ান এবং কোয়ার্টাইল নির্দেশ করে। e ভায়োলিন প্লট যা LUAD-TCGA ডেটাসেটে স্বাভাবিক ফুসফুসের টিস্যুর (n = 59) তুলনায় ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমাতে (n = 513) SLC7A5 এবং QPRT-এর স্বাভাবিককৃত Log2TPM (ট্রান্সক্রিপ্টস পার মিলিয়ন) mRNA এক্সপ্রেশন দেখাচ্ছে। সাদা বাক্সটি ইন্টারকোয়ার্টাইল রেঞ্জ, কেন্দ্রের অনুভূমিক কালো রেখাটি মিডিয়ান এবং বাক্স থেকে প্রসারিত উল্লম্ব কালো রেখাটি ৯৫% কনফিডেন্স ইন্টারভাল (CI) নির্দেশ করে। f টিসিজিএ ডেটাসেটে ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (n = 513) এবং স্বাভাবিক ফুসফুসের টিস্যুতে (n = 59) SLC7A5 এবং GAPDH এক্সপ্রেশনের পিয়ারসন কোরিলেশন প্লট। ধূসর এলাকাটি ৯৫% CI নির্দেশ করে। r, পিয়ারসন কোরিলেশন কোএফিসিয়েন্ট। g LC-MS/MS দ্বারা নির্ধারিত ননস্পেসিফিক shRNA কন্ট্রোল (NC) এবং shSLC7A5 (Sh1, Sh2) দ্বারা ট্রান্সফেক্টেড A549 কোষের নরমালাইজড সেলুলার ট্রিপটোফ্যান লেভেল। প্রতিটি গ্রুপের পাঁচটি জৈবিকভাবে স্বাধীন নমুনার পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ উপস্থাপন করা হয়েছে। h A549 কোষ (NC) এবং SLC7A5 নকডাউন A549 কোষ (Sh1, Sh2)-এ NADt (মোট NAD, যার মধ্যে NAD+ এবং NADH অন্তর্ভুক্ত)-এর সেলুলার লেভেল। প্রতিটি গ্রুপের তিনটি জৈবিকভাবে স্বাধীন নমুনার পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ উপস্থাপন করা হয়েছে। i SLC7A5 নকডাউনের আগে ও পরে A549 কোষের গ্লাইকোলাইটিক কার্যকলাপ এক্সট্রাসেলুলার অ্যাসিডিফিকেশন রেট (ECAR) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল (প্রতি গ্রুপে n = ৪টি জৈবিকভাবে স্বাধীন নমুনা)। ২-ডিজি,২-ডিঅক্সি-ডি-গ্লুকোজ। (b–h)-তে দ্বি-পুচ্ছ স্টুডেন্ট'স টি পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল। (g–i)-তে, ত্রুটি বারগুলি গড় ± এসডি (স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন) নির্দেশ করে, প্রতিটি পরীক্ষা স্বাধীনভাবে তিনবার করা হয়েছিল এবং ফলাফলগুলি একই রকম ছিল। উৎস ডেটা সোর্স ডেটা ফাইল আকারে সরবরাহ করা হয়েছে।
LA গ্রুপে পরিবর্তিত ট্রিপটোফ্যান বিপাকের উল্লেখযোগ্য প্রভাব বিবেচনা করে, আমরা QQQ ব্যবহার করে HC, BN, এবং LA গ্রুপেও সিরাম ট্রিপটোফ্যানের মাত্রা মূল্যায়ন করেছি। আমরা দেখেছি যে HC বা BN-এর তুলনায় LA-তে সিরাম ট্রিপটোফ্যান হ্রাস পেয়েছে (p < 0.001, চিত্র 5d), যা পূর্ববর্তী গবেষণার ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে ফুসফুসের ক্যান্সারে আক্রান্ত রোগীদের রক্তে সঞ্চালিত ট্রিপটোফ্যানের মাত্রা কন্ট্রোল গ্রুপের সুস্থ ব্যক্তিদের তুলনায় কম থাকে³³,³⁴,³⁵। PET/CT ট্রেসার 11C-মিথাইল-L-ট্রিপটোফ্যান ব্যবহার করে করা আরেকটি গবেষণায় দেখা গেছে যে, সৌম্য ক্ষত বা স্বাভাবিক টিস্যুর তুলনায় ফুসফুসের ক্যান্সার টিস্যুতে ট্রিপটোফ্যান সংকেত ধরে রাখার সময় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে³⁶। আমরা অনুমান করছি যে LA সিরামে ট্রিপটোফ্যানের এই হ্রাস ফুসফুসের ক্যান্সার কোষ দ্বারা সক্রিয় ট্রিপটোফ্যান শোষণের প্রতিফলন হতে পারে।
এটিও জানা যায় যে ট্রিপ্টোফ্যান ক্যাটাবলিজমের কাইনুরেনিন পথের শেষ উৎপাদ হল NAD+37,38, যা গ্লাইকোলাইসিসে 1,3-বিসফসফোগ্লিসারেটের সাথে গ্লিসারালডিহাইড-3-ফসফেটের বিক্রিয়ার জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ সাবস্ট্রেট39। যদিও পূর্ববর্তী গবেষণাগুলি ইমিউন নিয়ন্ত্রণে ট্রিপ্টোফ্যান ক্যাটাবলিজমের ভূমিকার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে, আমরা বর্তমান গবেষণায় পরিলক্ষিত ট্রিপ্টোফ্যান ডিসরেগুলেশন এবং গ্লাইকোলাইটিক পথের মধ্যে পারস্পরিক ক্রিয়া ব্যাখ্যা করার চেষ্টা করেছি। সলিউট ট্রান্সপোর্টার ফ্যামিলি 7 মেম্বার 5 (SLC7A5) একটি ট্রিপ্টোফ্যান ট্রান্সপোর্টার হিসেবে পরিচিত43,44,45। কুইনোলিনিক অ্যাসিড ফসফোরিবোসিলট্রান্সফেরেজ (QPRT) হল কাইনুরেনিন পথের ডাউনস্ট্রিমে অবস্থিত একটি এনজাইম যা কুইনোলিনিক অ্যাসিডকে NAMN-এ রূপান্তরিত করে46। LUAD TCGA ডেটাসেট পরীক্ষা করে দেখা গেছে যে স্বাভাবিক টিস্যুর তুলনায় টিউমার টিস্যুতে SLC7A5 এবং QPRT উভয়ই উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড ছিল (চিত্র 5e)। ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার প্রথম ও দ্বিতীয় পর্যায়ের পাশাপাশি তৃতীয় ও চতুর্থ পর্যায়েও এই বৃদ্ধি পরিলক্ষিত হয়েছে (পরিশিষ্ট চিত্র ১১), যা টিউমার সৃষ্টির সাথে সম্পর্কিত ট্রিপটোফ্যান বিপাকের প্রাথমিক ব্যাঘাত নির্দেশ করে।
অতিরিক্তভাবে, LUAD-TCGA ডেটাসেটটি ক্যান্সার রোগীর নমুনায় SLC7A5 এবং GAPDH mRNA এক্সপ্রেশনের মধ্যে একটি ধনাত্মক পারস্পরিক সম্পর্ক দেখিয়েছে (r = 0.45, p = 1.55E-26, চিত্র 5f)। এর বিপরীতে, স্বাভাবিক ফুসফুসের টিস্যুতে এই ধরনের জিন সিগনেচারের মধ্যে কোনো উল্লেখযোগ্য পারস্পরিক সম্পর্ক পাওয়া যায়নি (r = 0.25, p = 0.06, চিত্র 5f)। A549 কোষে SLC7A5-এর নকডাউন (পরিপূরক চিত্র 12) কোষীয় ট্রিপটোফ্যান এবং NAD(H)-এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে (চিত্র 5g,h), যার ফলে এক্সট্রাসেলুলার অ্যাসিডিফিকেশন রেট (ECAR) দ্বারা পরিমাপকৃত গ্লাইকোলাইটিক কার্যকলাপ হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 15i)। সুতরাং, সিরামের বিপাকীয় পরিবর্তন এবং ইন ভিট্রো সনাক্তকরণের উপর ভিত্তি করে, আমরা অনুমান করি যে ট্রিপটোফ্যান বিপাক কাইনুরেনিন পথের মাধ্যমে NAD+ তৈরি করতে পারে এবং ফুসফুসের ক্যান্সারে গ্লাইকোলাইসিসকে ত্বরান্বিত করতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে।
গবেষণায় দেখা গেছে যে, এলডিসিটি (LDCT) দ্বারা সনাক্ত হওয়া বিপুল সংখ্যক অনির্দিষ্ট পালমোনারি নডিউলের ক্ষেত্রে ম্যালিগন্যান্সির ফলস-পজিটিভ নির্ণয়ের কারণে পিইটি-সিটি (PET-CT), ফুসফুসের বায়োপসির মতো অতিরিক্ত পরীক্ষার প্রয়োজন হতে পারে এবং অতিরিক্ত চিকিৎসারও প্রয়োজন হতে পারে।৩১ চিত্র ৬-এ যেমন দেখানো হয়েছে, আমাদের গবেষণায় সম্ভাব্য রোগনির্ণয়মূলক মানসম্পন্ন একগুচ্ছ সিরাম মেটাবোলাইট শনাক্ত করা হয়েছে, যা সিটি (CT) দ্বারা সনাক্ত হওয়া পালমোনারি নডিউলগুলির ঝুঁকি স্তরবিন্যাস এবং পরবর্তী ব্যবস্থাপনার উন্নতি করতে পারে।
লো-ডোজ কম্পিউটেড টমোগ্রাফি (LDCT) ব্যবহার করে পালমোনারি নোডিউল মূল্যায়ন করা হয়, যার ইমেজিং বৈশিষ্ট্যগুলো সৌম্য বা ম্যালিগন্যান্ট কারণের ইঙ্গিত দেয়। নোডিউলের অনিশ্চিত ফলাফলের কারণে ঘন ঘন ফলো-আপ ভিজিট, অপ্রয়োজনীয় হস্তক্ষেপ এবং অতিরিক্ত চিকিৎসার প্রয়োজন হতে পারে। রোগ নির্ণয়ে কার্যকর সিরাম মেটাবলিক ক্লাসিফায়ারের অন্তর্ভুক্তি পালমোনারি নোডিউলের ঝুঁকি মূল্যায়ন এবং পরবর্তী ব্যবস্থাপনার উন্নতি করতে পারে। পিইটি (PET) পজিট্রন এমিশন টমোগ্রাফি।
মার্কিন NLST গবেষণা এবং ইউরোপীয় NELSON গবেষণার তথ্য থেকে জানা যায় যে, লো-ডোজ কম্পিউটেড টমোগ্রাফি (LDCT) ব্যবহার করে উচ্চ-ঝুঁকিপূর্ণ গোষ্ঠীর স্ক্রিনিং ফুসফুসের ক্যান্সারে মৃত্যুহার কমাতে পারে¹,³। তবে, LDCT দ্বারা আকস্মিকভাবে শনাক্ত হওয়া বিপুল সংখ্যক পালমোনারি নডিউলের ঝুঁকি মূল্যায়ন এবং পরবর্তী ক্লিনিক্যাল ব্যবস্থাপনা এখনও সবচেয়ে বড় চ্যালেঞ্জ। এর প্রধান লক্ষ্য হলো নির্ভরযোগ্য বায়োমার্কার অন্তর্ভুক্ত করে বিদ্যমান LDCT-ভিত্তিক প্রোটোকলগুলোর সঠিক শ্রেণিবিন্যাসকে উন্নত করা।
ফুসফুসের ক্যান্সারকে সুস্থ ব্যক্তির সাথে তুলনা করে রক্তের মেটাবোলাইটের মতো কিছু আণবিক বায়োমার্কার শনাক্ত করা হয়েছে¹⁵,¹⁷। বর্তমান গবেষণায়, আমরা এলডিসিটি (LDCT) দ্বারা আকস্মিকভাবে শনাক্ত হওয়া সৌম্য এবং ম্যালিগন্যান্ট পালমোনারি নোডিউলের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য সিরাম মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণের প্রয়োগের উপর মনোযোগ দিয়েছি। আমরা ইউপিএলসি-এইচআরএমএস (UPLC-HRMS) বিশ্লেষণ ব্যবহার করে সুস্থ ব্যক্তি (HC), সৌম্য ফুসফুসের নোডিউল (BN), এবং প্রথম পর্যায়ের ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LA) নমুনার সামগ্রিক সিরাম মেটাবোলোমের তুলনা করেছি। আমরা দেখেছি যে HC এবং BN-এর মেটাবলিক প্রোফাইল একই রকম ছিল, যেখানে LA, HC এবং BN-এর তুলনায় উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন দেখিয়েছে। আমরা দুই সেট সিরাম মেটাবোলাইট শনাক্ত করেছি যা LA-কে HC এবং BN থেকে আলাদা করে।
সৌম্য এবং ম্যালিগন্যান্ট নডিউল শনাক্তকরণের জন্য বর্তমান এলডিসিটি-ভিত্তিক পদ্ধতিটি মূলত সময়ের সাথে সাথে নডিউলের আকার, ঘনত্ব, গঠন এবং বৃদ্ধির হারের উপর ভিত্তি করে তৈরি। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে নডিউলের আকার ফুসফুসের ক্যান্সারের সম্ভাবনার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। এমনকি উচ্চ-ঝুঁকিপূর্ণ রোগীদের ক্ষেত্রেও, ৬ মিমি-এর কম আকারের নোডে ম্যালিগন্যান্সির ঝুঁকি ১%-এর কম। ৬ থেকে ২০ মিমি আকারের নডিউলের জন্য ম্যালিগন্যান্সির ঝুঁকি ৮% থেকে ৬৪% পর্যন্ত হয়ে থাকে। তাই, ফ্লেইশনার সোসাইটি নিয়মিত সিটি ফলো-আপের জন্য ৬ মিমি-এর একটি কাটঅফ ব্যাস সুপারিশ করে। তবে, ৬ মিমি-এর চেয়ে বড় অনির্দিষ্ট পালমোনারি নডিউল (আইপিএন)-এর ঝুঁকি মূল্যায়ন এবং ব্যবস্থাপনা পর্যাপ্তভাবে করা হয়নি। জন্মগত হৃদরোগের বর্তমান ব্যবস্থাপনা সাধারণত ঘন ঘন সিটি পর্যবেক্ষণের মাধ্যমে সতর্কতামূলক অপেক্ষার উপর ভিত্তি করে করা হয়।
যাচাইকৃত মেটাবোলোমের উপর ভিত্তি করে, আমরা প্রথমবারের মতো সুস্থ ব্যক্তি এবং ৬ মিমি-এর কম আকারের সৌম্য নডিউলের মধ্যে মেটাবোলোমিক বৈশিষ্ট্যের মিল প্রদর্শন করেছি। এই জৈবিক সাদৃশ্য পূর্ববর্তী সিটি স্ক্যানের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে দেখা গেছে যে ৬ মিমি-এর কম আকারের নডিউলের ক্ষেত্রে ম্যালিগন্যান্সির ঝুঁকি, নডিউলবিহীন ব্যক্তিদের মতোই কম।৩০ এটি উল্লেখ্য যে, আমাদের ফলাফলগুলি আরও দেখায় যে ৬ মিমি-এর কম এবং ৬ মিমি বা তার বেশি আকারের সৌম্য নডিউলগুলির মেটাবোলোমিক প্রোফাইলে উচ্চ সাদৃশ্য রয়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে নডিউলের আকার নির্বিশেষে সৌম্য কারণের কার্যকরী সংজ্ঞা সামঞ্জস্যপূর্ণ। সুতরাং, আধুনিক ডায়াগনস্টিক সিরাম মেটাবোলাইট প্যানেলগুলি সিটি স্ক্যানে প্রাথমিকভাবে নডিউল শনাক্ত হলে একটি একক পরীক্ষা হিসাবে কাজ করতে পারে এবং সম্ভাব্যভাবে ধারাবাহিক পর্যবেক্ষণ কমাতে পারে। একই সময়ে, মেটাবলিক বায়োমার্কারের একই প্যানেল ৬ মিমি বা তার বেশি আকারের ম্যালিগন্যান্ট নডিউলগুলিকে সৌম্য নডিউল থেকে আলাদা করেছে এবং সিটি স্ক্যান চিত্রে একই আকারের এবং অস্পষ্ট রূপগত বৈশিষ্ট্যযুক্ত আইপিএন-এর জন্য সঠিক পূর্বাভাস প্রদান করেছে। এই সিরাম মেটাবলিজম ক্লাসিফায়ারটি ০.৯২৭ AUC সহ ≥৬ মিমি আকারের নোডিউলের ম্যালিগন্যান্সি পূর্বাভাস প্রদানে ভালো ফল করেছে। সামগ্রিকভাবে, আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত দেয় যে স্বতন্ত্র সিরাম মেটাবলোমিক সিগনেচারগুলো বিশেষভাবে টিউমার-প্ররোচিত প্রাথমিক বিপাকীয় পরিবর্তনগুলোকে প্রতিফলিত করতে পারে এবং নোডিউলের আকার নির্বিশেষে ঝুঁকি পূর্বাভাসক হিসেবে এর সম্ভাব্য মূল্য রয়েছে।
উল্লেখ্য, ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LUAD) এবং স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা (LUSC) হলো নন-স্মল সেল লাং ক্যান্সার (NSCLC)-এর প্রধান প্রকারভেদ। যেহেতু LUSC তামাক ব্যবহারের সাথে দৃঢ়ভাবে সম্পর্কিত⁴⁷ এবং সিটি স্ক্রিনিং-এ আকস্মিকভাবে শনাক্ত হওয়া ফুসফুসের নোডিউলগুলোর মধ্যে LUAD হলো সবচেয়ে সাধারণ হিস্টোলজি⁴⁸, তাই আমাদের ক্লাসিফায়ার মডেলটি বিশেষভাবে স্টেজ I অ্যাডেনোকার্সিনোমা নমুনার জন্য তৈরি করা হয়েছিল। ওয়াং এবং তার সহকর্মীরাও LUAD-এর উপর মনোযোগ দিয়েছেন এবং লিপিডোমিক্স ব্যবহার করে নয়টি লিপিড সিগনেচার শনাক্ত করেছেন, যা সুস্থ ব্যক্তিদের থেকে প্রাথমিক পর্যায়ের ফুসফুসের ক্যান্সারকে আলাদা করতে পারে¹⁷। আমরা বর্তমান ক্লাসিফায়ার মডেলটি স্টেজ I LUSC-এর ১৬টি কেস এবং ৭৪টি বিনাইন নোডিউলের উপর পরীক্ষা করেছি এবং LUSC ভবিষ্যদ্বাণীর ক্ষেত্রে কম নির্ভুলতা (AUC ০.৭৭৬) লক্ষ্য করেছি, যা ইঙ্গিত দেয় যে LUAD এবং LUSC-এর নিজস্ব মেটাবোলোমিক সিগনেচার থাকতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, LUAD এবং LUSC-এর ইটিওলজি, জৈবিক উৎস এবং জেনেটিক অ্যাবারেশনের মধ্যে পার্থক্য দেখানো হয়েছে⁴⁹। সুতরাং, স্ক্রিনিং কর্মসূচিতে জনসংখ্যাভিত্তিক ফুসফুস ক্যান্সার শনাক্তকরণের জন্য প্রশিক্ষণ মডেলে অন্যান্য ধরনের হিস্টোলজি অন্তর্ভুক্ত করা উচিত।
এখানে, আমরা সুস্থ নিয়ন্ত্রণ এবং সৌম্য নোডিউলের তুলনায় ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমাতে সবচেয়ে ঘন ঘন পরিবর্তিত ছয়টি পথ চিহ্নিত করেছি। জ্যান্থিন এবং হাইপোজ্যান্থিন হল পিউরিন বিপাকীয় পথের সাধারণ বিপাকজাত পদার্থ। আমাদের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, সুস্থ নিয়ন্ত্রণ বা প্রাক-আক্রমণাত্মক পর্যায়ের রোগীদের তুলনায় ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা রোগীদের সিরাম বা টিস্যুতে পিউরিন বিপাকের সাথে সম্পর্কিত মধ্যবর্তী পদার্থগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে¹⁵,⁵⁰। সিরাম জ্যান্থিন এবং হাইপোজ্যান্থিনের উচ্চ মাত্রা দ্রুত বর্ধনশীল ক্যান্সার কোষগুলির জন্য প্রয়োজনীয় অ্যানাবোলিজমকে প্রতিফলিত করতে পারে। গ্লুকোজ বিপাকের নিয়ন্ত্রণহীনতা ক্যান্সার বিপাকের একটি সুপরিচিত বৈশিষ্ট্য⁵¹। এখানে, আমরা HC এবং BN গ্রুপের তুলনায় LA গ্রুপে পাইরুভেট এবং ল্যাকটেটের উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি, যা নন-স্মল সেল ফুসফুসের ক্যান্সার (NSCLC) রোগী এবং সুস্থ নিয়ন্ত্রণের সিরাম মেটাবোলোম প্রোফাইলে গ্লাইকোলাইটিক পথের অস্বাভাবিকতার পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ফলাফলগুলি সামঞ্জস্যপূর্ণ⁵²,⁵³।
গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার সিরামে পাইরুভেট এবং ট্রিপটোফ্যান বিপাকের মধ্যে একটি বিপরীত সম্পর্ক লক্ষ্য করেছি। HC বা BN গ্রুপের তুলনায় LA গ্রুপে সিরাম ট্রিপটোফ্যানের মাত্রা হ্রাস পেয়েছিল। মজার বিষয় হলো, একটি প্রসপেক্টিভ কোহর্ট ব্যবহার করে করা পূর্ববর্তী একটি বৃহৎ গবেষণায় দেখা গেছে যে রক্তে ট্রিপটোফ্যানের নিম্ন মাত্রা ফুসফুসের ক্যান্সারের ঝুঁকি বৃদ্ধির সাথে সম্পর্কিত ছিল 54। ট্রিপটোফ্যান একটি অত্যাবশ্যকীয় অ্যামিনো অ্যাসিড যা আমরা সম্পূর্ণরূপে খাদ্য থেকে পাই। আমরা এই সিদ্ধান্তে উপনীত হয়েছি যে ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমাতে সিরাম ট্রিপটোফ্যানের হ্রাস এই মেটাবোলাইটের দ্রুত ক্ষয়কে প্রতিফলিত করতে পারে। এটি সুপরিচিত যে কাইনুরেনিন পথের মাধ্যমে ট্রিপটোফ্যান ক্যাটাবলিজমের শেষ উৎপাদটি ডি নভো NAD+ সংশ্লেষণের উৎস। যেহেতু NAD+ প্রাথমিকভাবে স্যালভেজ পথের মাধ্যমে উৎপাদিত হয়, তাই স্বাস্থ্য এবং রোগে ট্রিপটোফ্যান বিপাকে NAD+ এর গুরুত্ব এখনও নির্ধারণ করা বাকি আছে46। টিসিজিএ (TCGA) ডেটাবেসের উপর আমাদের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, স্বাভাবিক নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমাতে ট্রিপটোফ্যান ট্রান্সপোর্টার সলিউট ট্রান্সপোর্টার 7A5 (SLC7A5)-এর এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং এটি গ্লাইকোলাইটিক এনজাইম GAPDH-এর এক্সপ্রেশনের সাথে ধনাত্মকভাবে সম্পর্কিত। পূর্ববর্তী গবেষণাগুলো প্রধানত অ্যান্টিটিউমার ইমিউন প্রতিক্রিয়া দমনে ট্রিপটোফ্যান ক্যাটাবলিজমের ভূমিকার উপর আলোকপাত করেছে⁴⁰,⁴¹,⁴²। এখানে আমরা প্রদর্শন করছি যে, ফুসফুসের ক্যান্সার কোষে SLC7A5-এর নকডাউনের মাধ্যমে ট্রিপটোফ্যান গ্রহণকে বাধা দিলে কোষীয় NAD-এর মাত্রা পরবর্তীকালে হ্রাস পায় এবং এর সাথে গ্লাইকোলাইটিক কার্যকলাপও দুর্বল হয়ে পড়ে। সংক্ষেপে, আমাদের এই গবেষণাটি ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার ম্যালিগন্যান্ট রূপান্তরের সাথে সম্পর্কিত সিরাম মেটাবলিজমের পরিবর্তনের জন্য একটি জৈবিক ভিত্তি প্রদান করে।
NSCLC রোগীদের মধ্যে EGFR মিউটেশন হলো সবচেয়ে সাধারণ চালক মিউটেশন। আমাদের গবেষণায়, আমরা দেখেছি যে EGFR মিউটেশনযুক্ত রোগীদের (n = 41) সামগ্রিক মেটাবোলোমিক প্রোফাইল ওয়াইল্ড-টাইপ EGFR যুক্ত রোগীদের (n = 31) মতোই ছিল, যদিও আমরা কিছু EGFR মিউট্যান্ট রোগীর সিরামে অ্যাসাইলকার্নিটিনের মাত্রা হ্রাস পেয়েছি। অ্যাসাইলকার্নিটিনের প্রতিষ্ঠিত কাজ হলো সাইটোপ্লাজম থেকে মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যাট্রিক্সে অ্যাসাইল গ্রুপ পরিবহন করা, যা ফ্যাটি অ্যাসিডের জারণ ঘটিয়ে শক্তি উৎপাদন করে 55। আমাদের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, সাম্প্রতিক একটি গবেষণায়ও 102টি ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা টিস্যু নমুনার গ্লোবাল মেটাবোলোম বিশ্লেষণ করে EGFR মিউট্যান্ট এবং EGFR ওয়াইল্ড-টাইপ টিউমারের মধ্যে একই রকম মেটাবোলোম প্রোফাইল চিহ্নিত করা হয়েছে50। মজার বিষয় হলো, EGFR মিউট্যান্ট গ্রুপেও অ্যাসাইলকার্নিটিনের উপস্থিতি পাওয়া গেছে। অতএব, অ্যাসাইলকার্নিটিনের মাত্রার পরিবর্তন EGFR-প্ররোচিত বিপাকীয় পরিবর্তন এবং এর অন্তর্নিহিত আণবিক পথগুলিকে প্রতিফলিত করে কিনা, তা আরও গবেষণার দাবি রাখে।
উপসংহারে, আমাদের এই গবেষণাটি ফুসফুসের নোডিউলের ডিফারেনশিয়াল ডায়াগনোসিসের জন্য একটি সিরাম মেটাবলিক ক্লাসিফায়ার প্রতিষ্ঠা করে এবং সিটি স্ক্যান স্ক্রিনিংয়ের উপর ভিত্তি করে এমন একটি কর্মপ্রবাহ প্রস্তাব করে যা ঝুঁকি মূল্যায়নকে অপ্টিমাইজ করতে ও ক্লিনিক্যাল ব্যবস্থাপনাকে সহজতর করতে পারে।
এই গবেষণাটি সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার হাসপাতাল, সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটির ফার্স্ট অ্যাফিলিয়েটেড হাসপাতাল এবং ঝেংঝৌ ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার হাসপাতালের এথিক্স কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। ডিসকভারি এবং ইন্টারনাল ভ্যালিডেশন গ্রুপে, সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার সেন্টারের ক্যান্সার কন্ট্রোল অ্যান্ড প্রিভেনশন বিভাগ থেকে বার্ষিক স্বাস্থ্য পরীক্ষা করানো ব্যক্তিদের মধ্য থেকে ১৭৪টি সুস্থ ব্যক্তির সিরাম এবং ২৪৪টি বিনাইন নডিউলের সিরাম সংগ্রহ করা হয়েছিল। এছাড়া, সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার সেন্টার থেকে ১৬৬টি বিনাইন নডিউল এবং স্টেজ I ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার সিরাম সংগ্রহ করা হয়েছিল। এক্সটারনাল ভ্যালিডেশন কোহর্টে, সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটির ফার্স্ট অ্যাফিলিয়েটেড হাসপাতাল থেকে ৪৮টি বিনাইন নডিউলের কেস, ৩৯টি স্টেজ I ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার কেস এবং ঝেংঝৌ ক্যান্সার হাসপাতাল থেকে ২৪টি স্টেজ I ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার কেস অন্তর্ভুক্ত ছিল। সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার সেন্টার প্রতিষ্ঠিত মেটাবলিক ক্লাসিফায়ারের রোগ নির্ণয় ক্ষমতা পরীক্ষা করার জন্য স্টেজ I স্কোয়ামাস সেল ফুসফুস ক্যান্সারের ১৬টি কেসও সংগ্রহ করেছিল (রোগীর বৈশিষ্ট্য পরিপূরক সারণি ৫-এ দেখানো হয়েছে)। ডিসকভারি কোহর্ট এবং ইন্টারনাল ভ্যালিডেশন কোহর্ট থেকে নমুনাগুলো জানুয়ারি ২০১৮ থেকে মে ২০২০-এর মধ্যে সংগ্রহ করা হয়েছিল। এক্সটারনাল ভ্যালিডেশন কোহর্টের জন্য নমুনাগুলো আগস্ট ২০২১ থেকে অক্টোবর ২০২২-এর মধ্যে সংগ্রহ করা হয়েছিল। লিঙ্গগত পক্ষপাতিত্ব কমাতে, প্রতিটি কোহর্টে প্রায় সমান সংখ্যক পুরুষ ও মহিলা কেস অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। ডিসকভারি টিম এবং ইন্টারনাল রিভিউ টিম। অংশগ্রহণকারীদের লিঙ্গ তাদের স্ব-প্রতিবেদনের ভিত্তিতে নির্ধারণ করা হয়েছিল। সকল অংশগ্রহণকারীর কাছ থেকে অবহিত সম্মতি (informed consent) নেওয়া হয়েছিল এবং কোনো পারিশ্রমিক প্রদান করা হয়নি। বিশ্লেষণের সময় ২ থেকে ৫ বছর ধরে যাদের সিটি স্ক্যান স্কোর স্থিতিশীল ছিল, তাদের বিনাইন নডিউলযুক্ত রোগী হিসেবে গণ্য করা হয়েছিল। তবে এক্সটারনাল ভ্যালিডেশন নমুনার একটি কেস এর ব্যতিক্রম ছিল, যা অস্ত্রোপচারের আগে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং হিস্টোপ্যাথলজির মাধ্যমে রোগ নির্ণয় করা হয়েছিল। ক্রনিক ব্রঙ্কাইটিস এর ব্যতিক্রম ছিল। ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমার কেসগুলো ফুসফুস রিসেকশনের আগে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্যাথলজিক্যাল ডায়াগনোসিসের মাধ্যমে নিশ্চিত করা হয়েছিল। কোনো অ্যান্টিকোয়াগুল্যান্ট ছাড়া সিরাম সেপারেশন টিউবে খালি পেটে রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। রক্তের নমুনাগুলো কক্ষ তাপমাত্রায় ১ ঘণ্টা ধরে জমাট বাঁধানো হয়েছিল এবং তারপর সিরাম সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহের জন্য ৪°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ২৮৫১ × g গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। মেটাবোলাইট নিষ্কাশনের আগ পর্যন্ত সিরামের অ্যালিকোটগুলো -৮০°C তাপমাত্রায় হিমায়িত করে রাখা হয়েছিল। সান ইয়াত-সেন ইউনিভার্সিটি ক্যান্সার সেন্টারের ক্যান্সার প্রতিরোধ ও চিকিৎসা পরীক্ষা বিভাগ ৪০ থেকে ৫৫ বছর বয়সী ১০০ জন সুস্থ দাতার কাছ থেকে সিরামের একটি পুল সংগ্রহ করে, যাদের মধ্যে সমান সংখ্যক পুরুষ ও মহিলা ছিলেন। প্রতিটি দাতার নমুনার সমান পরিমাণ মিশ্রিত করা হয়েছিল, ফলস্বরূপ পুলটিকে অ্যালিকোট করে -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। সিরাম মিশ্রণটি গুণমান নিয়ন্ত্রণ এবং ডেটা প্রমিতকরণের জন্য রেফারেন্স উপাদান হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।
রেফারেন্স সিরাম এবং পরীক্ষার নমুনাগুলি গলানো হয়েছিল এবং একটি সম্মিলিত নিষ্কাশন পদ্ধতি (MTBE/মিথানল/জল) 56 ব্যবহার করে মেটাবোলাইটগুলি নিষ্কাশন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ৫০ μl সিরামের সাথে ২২৫ μl বরফ-ঠান্ডা মিথানল এবং ৭৫০ μl বরফ-ঠান্ডা মিথাইল টারশিয়ারি-বিউটাইল ইথার (MTBE) মেশানো হয়েছিল। মিশ্রণটি নাড়াচাড়া করে ১ ঘন্টার জন্য বরফের উপর ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপর নমুনাগুলি মেশানো হয়েছিল এবং অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড (13C-ল্যাকটেট, 13C3-পাইরুভেট, 13C-মিথিওনিন, এবং 13C6-আইসোলিউসিন, কেমব্রিজ আইসোটোপ ল্যাবরেটরিজ থেকে কেনা) ধারণকারী ১৮৮ μl MS-গ্রেড জলের সাথে ভর্টেক্স মিক্স করা হয়েছিল। এরপর মিশ্রণটিকে ৪ °C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ১৫,০০০ × g গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং নিচের স্তরটিকে পজিটিভ ও নেগেটিভ মোডে LC-MS বিশ্লেষণের জন্য দুটি টিউবে (প্রতিটিতে ১২৫ μL) স্থানান্তর করা হয়। সবশেষে, নমুনাটিকে একটি উচ্চ-গতির ভ্যাকুয়াম কনসেনট্রেটরে বাষ্পীভূত করে সম্পূর্ণ শুষ্ক করা হয়।
শুকনো মেটাবোলাইটগুলোকে ১২০ μl ৮০% অ্যাসিটোনাইট্রাইলে পুনর্গঠন করা হয়েছিল, ৫ মিনিট ধরে ভর্টেক্স করা হয়েছিল এবং ৪°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ১৫,০০০ × g গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। মেটাবোলোমিক্স গবেষণার জন্য সুপারন্যাট্যান্টগুলোকে মাইক্রোইনসার্টসহ অ্যাম্বার কাচের ভায়ালে স্থানান্তর করা হয়েছিল। একটি আল্ট্রা-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-হাই-রেজোলিউশন মাস স্পেকট্রোমেট্রি (UPLC-HRMS) প্ল্যাটফর্মে আনটার্গেটেড মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মেটাবোলাইটগুলোকে একটি ডায়োনেক্স আলটিমেট ৩০০০ UPLC সিস্টেম এবং একটি ACQUITY BEH অ্যামাইড কলাম (২.১ × ১০০ মিমি, ১.৭ μm, ওয়াটার্স) ব্যবহার করে পৃথক করা হয়েছিল। পজিটিভ আয়ন মোডে, মোবাইল ফেজগুলো ছিল ৯৫% (A) এবং ৫০% অ্যাসিটোনাইট্রাইল (B), যার প্রতিটিতে ১০ mmol/L অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট এবং ০.১% ফরমিক অ্যাসিড ছিল। নেগেটিভ মোডে, মোবাইল ফেজ A এবং B-তে যথাক্রমে ৯৫% এবং ৫০% অ্যাসিটোনাইট্রাইল ছিল, উভয় ফেজেই ১০ মিলিমোল/লিটার অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট ছিল, pH = ৯। গ্রেডিয়েন্ট প্রোগ্রামটি ছিল নিম্নরূপ: ০–০.৫ মিনিট, ২% B; ০.৫–১২ মিনিট, ২–৫০% B; ১২–১৪ মিনিট, ৫০–৯৮% B; ১৪–১৬ মিনিট, ৯৮% B; ১৬–১৬.১ মিনিট, ৯৮–২% B; ১৬.১–২০ মিনিট, ২% B। কলামটিকে ৪০°C তাপমাত্রায় এবং অটোস্যাম্পলারে নমুনাটিকে ১০°C তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল। প্রবাহের হার ছিল ০.৩ মিলি/মিনিট এবং ইনজেকশনের পরিমাণ ছিল ৩ মাইক্রোলিটার। বিপুল পরিমাণে ডেটা সংগ্রহের জন্য, একটি ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন (ESI) উৎসসহ একটি Q-Exactive Orbitrap ভর বর্ণালিবীক্ষণ যন্ত্র (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ফুল স্ক্যান মোডে চালনা করা হয়েছিল এবং ddMS2 মনিটরিং মোডের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। MS প্যারামিটারগুলো নিম্নরূপে সেট করা হয়েছিল: স্প্রে ভোল্টেজ +৩.৮ kV/-৩.২ kV, ক্যাপিলারি তাপমাত্রা ৩২০°C, শিল্ডিং গ্যাস ৪০ arb, অক্সিলিয়ারি গ্যাস ১০ arb, প্রোব হিটার তাপমাত্রা ৩৫০°C, স্ক্যানিং পরিসীমা ৭০–১০৫০ m/h, রেজোলিউশন ৭০,০০০। Xcalibur 4.1 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল।
ডেটার গুণমান যাচাই করার জন্য, প্রতিটি নমুনা থেকে সুপারন্যাট্যান্টের ১০ μL অ্যালিকোট অপসারণ করে পুলড কোয়ালিটি কন্ট্রোল (QC) নমুনা তৈরি করা হয়েছিল। UPLC-MS সিস্টেমের স্থিতিশীলতা যাচাই করার জন্য অ্যানালিটিক্যাল সিকোয়েন্সের শুরুতে ছয়টি কোয়ালিটি কন্ট্রোল নমুনা ইনজেকশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এরপর কোয়ালিটি কন্ট্রোল নমুনাগুলো পর্যায়ক্রমে ব্যাচে অন্তর্ভুক্ত করা হয়। এই গবেষণার সিরাম নমুনার ১১টি ব্যাচই LC-MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নিষ্কাশন প্রক্রিয়া পর্যবেক্ষণ করতে এবং ব্যাচ-টু-ব্যাচ প্রভাব সমন্বয় করার জন্য, ১০০ জন সুস্থ দাতার সিরাম পুল মিশ্রণের অ্যালিকোট সংশ্লিষ্ট ব্যাচগুলোতে রেফারেন্স উপাদান হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। ডিসকভারি কোহর্ট, ইন্টারনাল ভ্যালিডেশন কোহর্ট এবং এক্সটারনাল ভ্যালিডেশন কোহর্টের আনটার্গেটেড মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণ সান ইয়াত-সেন বিশ্ববিদ্যালয়ের মেটাবোলোমিক্স সেন্টারে সম্পন্ন করা হয়েছিল। ক্লাসিফায়ার মডেলের কার্যকারিতা পরীক্ষা করার জন্য গুয়াংডং ইউনিভার্সিটি অফ টেকনোলজি অ্যানালাইসিস অ্যান্ড টেস্টিং সেন্টারের এক্সটারনাল ল্যাবরেটরিও এক্সটারনাল কোহর্ট থেকে ৪০টি নমুনা বিশ্লেষণ করেছিল।
নিষ্কাশন এবং পুনর্গঠনের পর, মাল্টিপল রিঅ্যাকশন মনিটরিং (MRM) মোডে একটি ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন (ESI) উৎস সহ আল্ট্রা-হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (অ্যাজিলেন্ট ৬৪৯৫ ট্রিপল কোয়াড্রুপল) ব্যবহার করে সিরাম মেটাবোলাইটগুলির পরম পরিমাণ পরিমাপ করা হয়েছিল। মেটাবোলাইটগুলিকে পৃথক করার জন্য একটি অ্যাকুইটি বিইএইচ অ্যামাইড কলাম (২.১ × ১০০ মিমি, ১.৭ মাইক্রোমিটার, ওয়াটার্স) ব্যবহার করা হয়েছিল। মোবাইল ফেজটি ৯০% (A) এবং ৫% অ্যাসিটোনাইট্রাইল (B) এর সাথে ১০ মিলিমোল/লিটার অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট এবং ০.১% অ্যামোনিয়া দ্রবণ দ্বারা গঠিত ছিল। গ্রেডিয়েন্ট প্রোগ্রামটি নিম্নরূপ ছিল: ০–১.৫ মিনিট, ০% B; ১.৫–৬.৫ মিনিট, ০–১৫% B; ৬.৫–৮ মিনিট, ১৫% B; ৮–৮.৫ মিনিট, ১৫%–০% B; ৮.৫–১১.৫ মিনিট, ০% B। অটোস্যাম্পলারে কলামটিকে ৪০ °C এবং নমুনাটিকে ১০ °C তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল। প্রবাহের হার ছিল ০.৩ mL/min এবং ইনজেকশনের পরিমাণ ছিল ১ μL। MS প্যারামিটারগুলো নিম্নরূপে সেট করা হয়েছিল: ক্যাপিলারি ভোল্টেজ ±৩.৫ kV, নেবুলাইজার চাপ ৩৫ psi, শিথ গ্যাস প্রবাহ ১২ L/min, শিথ গ্যাসের তাপমাত্রা ৩৫০°C, ড্রাইং গ্যাসের তাপমাত্রা ২৫০°C, এবং ড্রাইং গ্যাস প্রবাহ ১৪ l/min। ট্রিপটোফ্যান, পাইরুভেট, ল্যাকটেট, হাইপোক্সান্থিন এবং জ্যান্থিনের MRM রূপান্তরগুলো ছিল যথাক্রমে ২০৫.০–১৮৭.৯, ৮৭.০–৪৩.৪, ৮৯.০–৪৩.৩, ১৩৫.০–৯২.৩ এবং ১৫১.০–১০৭.৯। Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) ব্যবহার করে ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। সিরাম নমুনার ক্ষেত্রে, স্ট্যান্ডার্ড মিশ্রণ দ্রবণের ক্যালিব্রেশন কার্ভ ব্যবহার করে ট্রিপটোফ্যান, পাইরুভেট, ল্যাকটেট, হাইপোক্সান্থিন এবং জ্যান্থিনের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল। কোষের নমুনার ক্ষেত্রে, ট্রিপটোফ্যানের পরিমাণকে ইন্টারনাল স্ট্যান্ডার্ড এবং কোষ প্রোটিনের ভরের সাপেক্ষে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
কম্পাউন্ড ডিসকভারি ৩.১ এবং ট্রেসফাইন্ডার ৪.০ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পিক এক্সট্র্যাকশন (m/z এবং রিটেনশন টাইম (RT)) করা হয়েছিল। ব্যাচগুলোর মধ্যে সম্ভাব্য পার্থক্য দূর করার জন্য, আপেক্ষিক প্রাচুর্য নির্ণয়ের উদ্দেশ্যে টেস্ট স্যাম্পলের প্রতিটি ক্যারেক্টারিস্টিক পিককে একই ব্যাচের রেফারেন্স মেটেরিয়ালের ক্যারেক্টারিস্টিক পিক দ্বারা ভাগ করা হয়েছিল। স্ট্যান্ডার্ডাইজেশনের আগে ও পরে ইন্টারনাল স্ট্যান্ডার্ডগুলোর আপেক্ষিক স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন সাপ্লিমেন্টারি টেবিল ৬-এ দেখানো হয়েছে। দুটি গ্রুপের মধ্যে পার্থক্য ফলস ডিসকভারি রেট (FDR<0.05, উইলকক্সন সাইনড র‍্যাঙ্ক টেস্ট) এবং ফোল্ড চেঞ্জ (>1.2 বা <0.83) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। এক্সট্র্যাক্ট করা ফিচারগুলোর র MS ডেটা এবং রেফারেন্স সিরাম-সংশোধিত MS ডেটা যথাক্রমে সাপ্লিমেন্টারি ডেটা ১ এবং সাপ্লিমেন্টারি ডেটা ২-এ দেখানো হয়েছে। শনাক্তকরণের চারটি সংজ্ঞায়িত স্তরের উপর ভিত্তি করে পিক অ্যানোটেশন করা হয়েছিল, যার মধ্যে রয়েছে শনাক্তকৃত মেটাবোলাইট, সম্ভাব্য অ্যানোটেটেড যৌগ, সম্ভাব্য বৈশিষ্ট্যযুক্ত যৌগ শ্রেণি এবং অজানা যৌগ 22। কম্পাউন্ড ডিসকভারি ৩.১ (mzCloud, HMDB, Chemspider)-এ ডাটাবেস অনুসন্ধানের উপর ভিত্তি করে, mzCloud (স্কোর > ৮৫) বা Chemspider-এ যাচাইকৃত স্ট্যান্ডার্ড বা সঠিক মিল থাকা MS/MS অ্যানোটেশনযুক্ত জৈব যৌগগুলোকে অবশেষে ডিফারেনশিয়াল মেটাবোলোমের মধ্যবর্তী যৌগ হিসেবে নির্বাচন করা হয়েছিল। প্রতিটি বৈশিষ্ট্যের জন্য পিক অ্যানোটেশন সাপ্লিমেন্টারি ডেটা ৩-এ অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে। সাম-নরম্যালাইজড মেটাবোলাইট অ্যাবানডেন্সের ইউনিভ্যারিয়েট বিশ্লেষণের জন্য মেটাবোঅ্যানালিস্ট ৫.০ ব্যবহার করা হয়েছিল। মেটাবোঅ্যানালিস্ট ৫.০ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন মেটাবোলাইটের উপর ভিত্তি করে KEGG পাথওয়ে এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণও মূল্যায়ন করেছে। স্ট্যাক নরম্যালাইজেশন এবং অটোস্কেলিং সহ ropls সফটওয়্যার প্যাকেজ (v.1.26.4) ব্যবহার করে প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) এবং পার্শিয়াল লিস্ট স্কোয়ার্স ডিসক্রিমিন্যান্ট অ্যানালাইসিস (PLS-DA) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। লিস্ট অ্যাবসোলিউট শ্রিঙ্কেজ অ্যান্ড সিলেকশন অপারেটর (LASSO, R প্যাকেজ v.4.1-3) সহ বাইনারি লজিস্টিক রিগ্রেশন ব্যবহার করে নোডিউল ম্যালিগন্যান্সি পূর্বাভাসের জন্য সর্বোত্তম মেটাবোলাইট বায়োমার্কার মডেল তৈরি করা হয়েছিল। pROC প্যাকেজ (v.1.18.0.) অনুসারে ROC বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে AUC অনুমানের মাধ্যমে ডিটেকশন এবং ভ্যালিডেশন সেটে ডিসক্রিমিন্যান্ট মডেলের পারফরম্যান্স চিহ্নিত করা হয়েছিল। মডেলটির সর্বোচ্চ ইউডেন সূচকের (সংবেদনশীলতা + নির্দিষ্টতা – ১) উপর ভিত্তি করে সর্বোত্তম সম্ভাব্যতা কাটঅফ পাওয়া গিয়েছিল। থ্রেশহোল্ডের চেয়ে কম বা বেশি মানযুক্ত নমুনাগুলিকে যথাক্রমে সৌম্য নোডিউল এবং ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা হিসাবে চিহ্নিত করা হবে।
A549 কোষ (#CCL-185, আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন) ১০% FBS যুক্ত F-12K মাধ্যমে প্রতিপালন করা হয়েছিল। SLC7A5-কে লক্ষ্য করে শর্ট হেয়ারপিন আরএনএ (shRNA) সিকোয়েন্স এবং একটি নন-টার্গেটিং কন্ট্রোল (NC) লেন্টিভাইরাল ভেক্টর pLKO.1-puro-তে প্রবেশ করানো হয়েছিল। shSLC7A5-এর অ্যান্টিসেন্স সিকোয়েন্সগুলো হলো: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′)। SLC7A5 (#5347) এবং টিউবুলিন (#2148)-এর অ্যান্টিবডি সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি থেকে কেনা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের জন্য SLC7A5 এবং টিউবুলিনের অ্যান্টিবডি ১:১০০০ অনুপাতে ব্যবহার করা হয়েছিল।
সিহর্স এক্সএফ গ্লাইকোলাইটিক স্ট্রেস টেস্টের মাধ্যমে কোষের বাইরের অম্লীকরণের (ECAR) মাত্রা পরিমাপ করা হয়। এই পরীক্ষায়, ECAR দ্বারা পরিমাপকৃত কোষীয় গ্লাইকোলাইটিক ক্ষমতা পরীক্ষা করার জন্য পর্যায়ক্রমে গ্লুকোজ, অলিগোমাইসিন এ এবং ২-ডিজি প্রয়োগ করা হয়।
নন-টার্গেটিং কন্ট্রোল (NC) এবং shSLC7A5 (Sh1, Sh2) দ্বারা ট্রান্সফেক্টেড A549 কোষগুলোকে ১০ সেমি ব্যাসের ডিশে সারারাত ধরে প্লেট করা হয়েছিল। কোষের মেটাবোলাইটগুলো ১ মিলি বরফ-ঠান্ডা ৮০% জলীয় মিথানল দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল। মিথানল দ্রবণে থাকা কোষগুলোকে চেঁছে তুলে একটি নতুন টিউবে সংগ্রহ করা হয় এবং ৪°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ১৫,০০০ × g গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। ৮০০ µl সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করে একটি উচ্চ-গতির ভ্যাকুয়াম কনসেনট্রেটর ব্যবহার করে শুকানো হয়। এরপর শুকনো মেটাবোলাইট পেললেটগুলোতে উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে LC-MS/MS ব্যবহার করে ট্রিপটোফ্যানের মাত্রা বিশ্লেষণ করা হয়। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে একটি পরিমাণগত NAD+/NADH কালারমেট্রিক কিট (#K337, BioVision) ব্যবহার করে A549 কোষে (NC এবং shSLC7A5) কোষীয় NAD(H)-এর মাত্রা পরিমাপ করা হয়। মেটাবোলাইটের পরিমাণকে স্বাভাবিক করার জন্য প্রতিটি নমুনার প্রোটিনের মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল।
নমুনার আকার প্রাথমিকভাবে নির্ধারণ করার জন্য কোনো পরিসংখ্যানগত পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়নি। বায়োমার্কার আবিষ্কারের লক্ষ্যে পরিচালিত পূর্ববর্তী মেটাবোলোমিক্স গবেষণাসমূহ¹⁵,¹⁸-কে নমুনার আকার নির্ধারণের জন্য মানদণ্ড হিসেবে বিবেচনা করা হয়েছে, এবং এই প্রতিবেদনগুলোর তুলনায় আমাদের নমুনা পর্যাপ্ত ছিল। গবেষণা দল থেকে কোনো নমুনা বাদ দেওয়া হয়নি। আনটার্গেটেড মেটাবোলোমিক্স গবেষণার জন্য সিরামের নমুনাগুলোকে দৈবচয়নের ভিত্তিতে একটি ডিসকভারি গ্রুপ (৩০৬টি নমুনা, ৭৪.৬%) এবং একটি ইন্টারনাল ভ্যালিডেশন গ্রুপে (১০৪টি নমুনা, ২৫.৪%) ভাগ করা হয়েছিল। টার্গেটেড মেটাবোলোমিক্স গবেষণার জন্য আমরা ডিসকভারি সেট থেকে প্রতিটি গ্রুপ থেকে দৈবচয়নের ভিত্তিতে ৭০টি করে নমুনাও নির্বাচন করেছিলাম। এলসি-এমএস ডেটা সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণের সময় গবেষকদের গ্রুপ নির্ধারণ সম্পর্কে জানানো হয়নি। মেটাবোলোমিক্স ডেটা এবং কোষ পরীক্ষার পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ যথাক্রমে ফলাফল, চিত্রের ব্যাখ্যা এবং পদ্ধতি বিভাগে বর্ণনা করা হয়েছে। কোষীয় ট্রিপটোফ্যান, এনএডিটি এবং গ্লাইকোলাইটিক কার্যকলাপের পরিমাণ নির্ণয় তিনটি স্বাধীনভাবে করা হয়েছিল এবং প্রতিটি পরীক্ষায় একই ফলাফল পাওয়া গিয়েছিল।
গবেষণাটির নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে সংযুক্ত ন্যাচারাল পোর্টফোলিও রিপোর্ট অ্যাবস্ট্রাক্টটি দেখুন।
নিষ্কাশিত বৈশিষ্ট্যগুলির কাঁচা MS ডেটা এবং রেফারেন্স সিরামের স্বাভাবিককৃত MS ডেটা যথাক্রমে পরিপূরক ডেটা ১ এবং পরিপূরক ডেটা ২-এ দেখানো হয়েছে। ডিফারেনশিয়াল বৈশিষ্ট্যগুলির জন্য শীর্ষ টীকা পরিপূরক ডেটা ৩-এ উপস্থাপন করা হয়েছে। LUAD TCGA ডেটাসেটটি https://portal.gdc.cancer.gov/ থেকে ডাউনলোড করা যাবে। গ্রাফ অঙ্কনের জন্য ইনপুট ডেটা উৎস ডেটাতে প্রদান করা হয়েছে। এই নিবন্ধটির জন্য উৎস ডেটা প্রদান করা হয়েছে।
ন্যাশনাল লাং স্ক্রিনিং স্টাডি গ্রুপ, ইত্যাদি। স্বল্প-মাত্রার কম্পিউটেড টমোগ্রাফির মাধ্যমে ফুসফুসের ক্যান্সারে মৃত্যুহার হ্রাস। নর্দার্ন ইংল্যান্ড জে. মেড. ৩৬৫, ৩৯৫–৪০৯ (২০১১)।
ক্রেমার, বিএস, বার্গ, কেডি, অ্যাবারলে, ডিআর এবং প্রফেট, পিসি স্বল্প-মাত্রার হেলিকাল সিটি ব্যবহার করে ফুসফুসের ক্যান্সার স্ক্রিনিং: জাতীয় ফুসফুস স্ক্রিনিং গবেষণা (NLST) থেকে প্রাপ্ত ফলাফল। জে. মেড. স্ক্রিন ১৮, ১০৯–১১১ (২০১১)।
ডি কোনিং, এইচজে, প্রমুখ। একটি র‍্যান্ডমাইজড ট্রায়ালে ভলিউমেট্রিক সিটি স্ক্রিনিংয়ের মাধ্যমে ফুসফুসের ক্যান্সারে মৃত্যুহার হ্রাস। নর্দার্ন ইংল্যান্ড জে. মেড. ৩৮২, ৫০৩–৫১৩ (২০২০)।